本文由吉康醫(yī)學(xué)學(xué)術(shù)團(tuán)隊(duì)劉濤博士撰文

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外泌體(Exosomes)是一種能被機(jī)體內(nèi)大多數(shù)細(xì)胞分泌的微小膜泡，具有脂質(zhì)雙層膜,，直徑大約為30-150 nm,。外泌體廣泛存在并分布于各種體液中，攜帶和傳遞重要的信號(hào)分子,，形成了一種全新的細(xì)胞-細(xì)胞間信息傳遞系統(tǒng),，影響細(xì)胞的生理狀態(tài)并與多種疾病的發(fā)生與進(jìn)程密切相關(guān)。幾乎所有類型的細(xì)胞都可以分泌外泌體,，同時(shí)外泌體也廣泛存在于體液中,，包括血液、眼淚,、尿液,、唾液、乳汁,、腹水等,。目前研究發(fā)現(xiàn)外泌體中富含核酸(MicroRNA、lncRNA,、circRNA,、mRNA,、tRNA等)、蛋白,、膽固醇等,。外泌體的表面marker主要有CD63、CD81,、CD9,、TSG101、HSP27等,。外泌體的產(chǎn)生過程為：細(xì)胞膜內(nèi)陷,，形成內(nèi)體(Endosome)，再形成多泡體(Multivesicular bodies,，MVB),，最后分泌到胞外成為外泌體。外泌體中攜帶有母細(xì)胞的多種蛋白質(zhì),、脂類,、DNA和RNA等重要信息。

外泌體是直徑30-100 nm的顆粒,，所有類型的細(xì)胞都能分泌,。這些脂質(zhì)雙層顆粒富含膽固醇、神經(jīng)酰胺和磷脂酰絲氨酸,，其脂質(zhì)含量與親本細(xì)胞不同,。在大多數(shù)外體中普遍存在的標(biāo)志物包括Tetraspanins(CD9、CD63和CD81),；熱休克蛋白,；粘附分子；以及ESCRT(運(yùn)輸所需的內(nèi)體分選復(fù)合物)途徑的標(biāo)志物,，包括LAMP1和TSG101,。

一.外泌體簡(jiǎn)介

1.外泌體內(nèi)容物

癌癥來源的外泌體含大量的內(nèi)含物，由microRNAs,、mRNAs,、轉(zhuǎn)錄因子、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)等成,。microRNAs是小的,、非編碼的RNA，通常是20-25個(gè)核苷酸的長(zhǎng)序列,，一旦進(jìn)入受體細(xì)胞,，就與目標(biāo)mRNA序列結(jié)合并抑制翻譯。已發(fā)現(xiàn)miRNA在大多數(shù)癌癥中表達(dá)失調(diào),。不同細(xì)胞來源的外泌體的miRNA特征是不同的,。許多miRNA是腫瘤特異性的,，因此可以用作診斷和預(yù)后的生物標(biāo)記物。

外泌體的結(jié)構(gòu)和內(nèi)含物,。外泌體是小的膜結(jié)合囊泡,，與質(zhì)膜具有相似的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)。外泌體攜帶的脂質(zhì)雙層膜結(jié)構(gòu)含有典型的跨膜蛋白和受體,，如跨膜蛋白PGRL、LAMP1/2,、CD13,，膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白如膜聯(lián)蛋白和RABS蛋白，粘附分子如ICAM-1,、乳膠黏附和整合素,，脂筏相關(guān)蛋白如Flotillins、LBPA,、膽固醇,、胃素和Tetraspanins，最具特征的是CD63和CD81,。此外,，胞外體膜表面還組裝有免疫調(diào)節(jié)分子，如MHC-I和-II,、CD80和CD86,。在外腔內(nèi)可以找到幾種穩(wěn)定和保存“信息”的外體貨物的蛋白質(zhì)：細(xì)胞骨架蛋白，HSPs,，最典型的是HSP70,，細(xì)胞骨架蛋白(Vimentin，cofilin,，Tublin,，Talin，actin),，代謝酶(GAPDH,，A TPase，pgk1),，以及參與MVB形成的蛋白質(zhì),，如Alixs，Tsg101,，clathrin,。外泌體的內(nèi)容物可以在微環(huán)境中從原始細(xì)胞轉(zhuǎn)移到靶細(xì)胞，包括RNA種類(mRNAs,、miRNAs和其他類型的短RNA)和大量不同的蛋白質(zhì),，取決于它們的宿主細(xì)胞,。

2.外泌體釋放途徑

外泌體是一類囊泡，其分泌途徑包括有效載荷及與血管內(nèi)皮的融合,。有證據(jù)表明,，有兩類血管內(nèi)皮細(xì)胞：富含膽固醇的分泌型血管內(nèi)皮細(xì)胞(SMVEs)和容易與溶酶體融合的低膽固醇血管內(nèi)皮細(xì)胞(LMVEs)。微泡產(chǎn)生于損傷或轉(zhuǎn)化細(xì)胞的膜脫落,。凋亡小體或凋亡體是從垂死的細(xì)胞或凋亡后殘留的細(xì)胞體中脫落的囊泡,。這些EVS的膜脂含量更接近于起源細(xì)胞的質(zhì)膜。外泌體也包括來自高爾基復(fù)合體的脂質(zhì),，使它們與質(zhì)膜更加不同,。

3.外泌體生物標(biāo)志物

細(xì)胞外蟆泡可基于其起源或大小分為凋亡小體、微泡體和外泌體,。外泌體是其中最小且最具特征的囊泡,，由不同種類細(xì)胞分泌釋放，包括神經(jīng)細(xì)胞及其起源的腫瘤細(xì)胞,，在神經(jīng)系統(tǒng)中發(fā)揮重要功能,。從血液和腦脊液中提取的外泌體是真核細(xì)胞用于交換蛋白質(zhì)unRNA和微小RZA等生物學(xué)信息的載體，這些生物分子參與細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo),、腫瘤細(xì)胞增殖遷移及血管生成,。外泌體不僅是一種新的生物學(xué)標(biāo)志物檢測(cè)方法，更可提供潛在的分子治療靶點(diǎn),，并且有望成為抗腫瘤藥物傳遞的載體,。

二.外泌體研究分析

1.外泌體和腫瘤干細(xì)胞

近年來，腫瘤干細(xì)胞(CSC)模型被提出并受到越來越多的關(guān)注,。集體研究表明,，這些CSCs可以啟動(dòng)腫瘤再生。它們能夠自我更新,，重現(xiàn)原始腫瘤的異質(zhì)性,，并在免疫功能低下的小鼠身上分化為新腫瘤的整體。

Bonnet和Dick首次證明了人類急性髓系白血病中CSCs的存在,。這些細(xì)胞與正常造血干細(xì)胞相似,，可向白血病克隆方向分化。該層次結(jié)構(gòu)與造血祖細(xì)胞的分化過程相似,，提出了腫瘤治療中靶向CSCs的必要性,。根據(jù)研究結(jié)果，美國癌癥研究協(xié)會(huì)在2006年提出了對(duì)CSC的一致定義,，即“腫瘤內(nèi)具有自我更新能力的細(xì)胞,，并導(dǎo)致組成腫瘤的癌細(xì)胞的異質(zhì)性譜系”。在殺死快速增殖的癌細(xì)胞的傳統(tǒng)治療下,，CSCs保持自我更新,，并增加腫瘤復(fù)發(fā)的風(fēng)險(xiǎn),。值得注意的是，集落進(jìn)化模型還表明,，CSCs可能與最初的致瘤細(xì)胞不同,。在疾病發(fā)展過程中，CSCs與莖相關(guān)的遺傳特征可能會(huì)發(fā)生一些變異,，導(dǎo)致表型和功能的切換,。因此，所謂的CSCs的致瘤特性只能用來指它們?cè)诋惙N移植中引起腫瘤的能力,，而不能用來解決來源細(xì)胞的問題,。CSCs是腫瘤發(fā)生的根源，具有乳腺干細(xì)胞的共同特征,，包括靜止、自我更新和分化潛能,。自我更新能力使BCSC具有有效修復(fù)DNA損傷的生存優(yōu)勢(shì),，而分化潛能使BCSC具有致瘤能力。微環(huán)境成分,，包括外體,、趨化因子和細(xì)胞外基質(zhì)，也通過與BCSC表面標(biāo)志物的相互作用在維持表型方面發(fā)揮重要作用,。這一作用通過細(xì)胞內(nèi)信號(hào)將多變的干細(xì)胞樣屬性與不同的腫瘤微環(huán)境緊密聯(lián)系在一起,。這些頑固性腫瘤細(xì)胞中的異常表達(dá)提示CSCs可能是腫瘤體積中免疫抑制機(jī)制的重要組成部分。

BCSCs治療耐藥的主要可能機(jī)制,。這些特征主要包括增強(qiáng)的自我更新能力(Notch,、Wnt和HH信號(hào))，增強(qiáng)的抗凋亡能力(PI3K信號(hào)),，增強(qiáng)的抗氧化能力(NRF2信號(hào)),，增加抗癌藥物的外流(ABCG2)，低氧狀態(tài)(HIF-1信號(hào)),，以及腫瘤微環(huán)境維持效應(yīng)(外體或趨化因子),。所有因素共同作用，導(dǎo)致了BCSC的耐藥表型,。

2.外泌體和自噬

自噬是一種應(yīng)激反應(yīng)的分解代謝過程,，溶酶體酶通過該過程降解細(xì)胞內(nèi)的成分。現(xiàn)在人們普遍認(rèn)為,，自噬在細(xì)胞和組織的動(dòng)態(tài)平衡以及新陳代謝,、發(fā)育和通過清除病原體而產(chǎn)生的免疫中起著至關(guān)重要的作用。有幾條降解途徑進(jìn)入溶酶體：一,，微型自噬,，胞漿物質(zhì)直接內(nèi)化到溶酶體后被降解,；二，伴侶介導(dǎo)的自噬,，通過它胞漿蛋白的子集被選擇性地降解,；三，宏自噬(以下簡(jiǎn)稱自噬),，處理胞質(zhì)物質(zhì)的分離和降解,。自噬是由許多不同的生理刺激或病理生理情況引起的。它還在細(xì)胞質(zhì)的質(zhì)量控制中發(fā)揮作用,，因?yàn)樗梢匀コ鞍踪|(zhì)聚集體,、受損的細(xì)胞器(例如，有缺陷的線粒體)和細(xì)胞內(nèi)的病原體(細(xì)菌和病毒),。自噬參與細(xì)胞內(nèi)成分的水平調(diào)節(jié)和循環(huán),，如氨基酸、脂質(zhì)(脂滴)和碳水化合物,，從而直接促進(jìn)細(xì)胞新陳代謝和能量調(diào)節(jié),。最后，自噬可以防止與衰老相關(guān)的細(xì)胞修飾,。因此,，這個(gè)復(fù)雜的膜通路，受許多因素調(diào)節(jié),，參與細(xì)胞策略,，以保護(hù)生物體免受癌癥、感染性疾病以及代謝,、肌肉,、炎癥和神經(jīng)退行性疾病的侵襲。相反,，自噬途徑的完全或部分失調(diào)會(huì)加重或?qū)е逻@些病理,。

哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的自噬途徑。哺乳動(dòng)物細(xì)胞中溶酶體的降解有三條自噬途徑：CMA通過與溶酶體表面的蛋白LAMP-2A相互作用將底物轉(zhuǎn)移到溶酶體上,。CMA需要底物上的靶向基序(KFERQ),；這個(gè)基序由伴侶Hsc70識(shí)別。微自噬通過直接內(nèi)陷溶酶體來隔離貨物,。宏自噬涉及形成稱為自噬小體的雙膜細(xì)胞器,，貨物被隔離在其中(起始和延伸步驟)。自噬小體與溶酶體融合,，在那里貨物被降解(成熟步驟),。自噬途徑有三個(gè)重要階段：自噬小體形成的起始階段(包括吞噬小體的形成)、伸長(zhǎng)/閉合階段(導(dǎo)致封閉的自噬小體的形成)和自噬小體的成熟(包括與溶酶體的融合)。構(gòu)成ATG蛋白質(zhì)核心機(jī)制的不同模塊由虛線分隔,。能量耗竭,、氨基酸和血清饑餓通過不同的信號(hào)通路激活ULK復(fù)合體，包括mTOR通路,。噬菌體來自內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的一個(gè)區(qū)域,，稱為omegasome。omegasome的特征是存在PI3P結(jié)合蛋白DFCP1,。PI3P用藍(lán)線表示,。還顯示了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位的跨膜蛋白VMP1，它與IIIPI3K復(fù)合物相互作用,。刺激ULK復(fù)合體激活這個(gè)復(fù)合體,，它由核心結(jié)構(gòu)(Beclin1，Vps15和Vps34)和兩個(gè)調(diào)節(jié)子(ATG14L和AMBRA1)組成,。這種誘導(dǎo)允許PI3P的產(chǎn)生促進(jìn)Wipi蛋白在兩個(gè)泛素樣接合體系統(tǒng)的上游募集,，這兩個(gè)泛素樣接合系統(tǒng)延長(zhǎng)并封閉了自噬體膜。第一結(jié)合系統(tǒng)導(dǎo)致形成ATG12-ATG5-ATG16L1復(fù)合物,，該復(fù)合物在第二結(jié)合系統(tǒng)中充當(dāng)E3樣酶,，其在未結(jié)合形式LC3-I下游產(chǎn)生脂化PE結(jié)合形式的LC3(LC3-II)。

自噬和外體之間新出現(xiàn)的相互作用?，F(xiàn)有的數(shù)據(jù)表明，自噬機(jī)制和外體生物發(fā)生之間存在多種可能的相互作用,。(A)自噬機(jī)制的子集可能有助于外體的生物發(fā)生,。作為一個(gè)例子，這里顯示的是ATG5-ATG16復(fù)合物,，它定位于MVB并介導(dǎo)LC3B的非正則脂化,。ATG5-ATG16復(fù)合物還有助于V-ATPase的解離，防止MVB的酸化和隨后的溶酶體降解,。然后,，MVBS與質(zhì)膜(右)融合，釋放外體,。(B)兩親體可以與PM融合并分泌其內(nèi)容物,。這里顯示的是依賴自噬的膜聯(lián)蛋白A2(ANXA2)的分泌，其中需要一個(gè)兩親體中間體來釋放胞質(zhì)ANXA2在外體中,。

3.外泌體和miRNA

自第一個(gè)microRNA(miRNA)被發(fā)現(xiàn)以來的短短二十多年間,，miRNA生物學(xué)領(lǐng)域得到了長(zhǎng)足的發(fā)展。對(duì)miRNAs在發(fā)育和疾病中的作用,，特別是在癌癥中的作用的深入了解,，使miRNAs成為新的治療方法的有吸引力的工具和靶點(diǎn)。功能研究已經(jīng)證實(shí)，miRNA失調(diào)是許多癌癥的原因,，miRNA作為腫瘤抑制基因或癌基因(OncomiRs)發(fā)揮作用,，miRNA模擬物和靶向miRNA的分子(AnttimiRs)在臨床前開發(fā)中顯示出希望。幾種miRNA靶向療法已經(jīng)進(jìn)入臨床開發(fā),，包括一種腫瘤抑制因子miRNA miR-34的模擬物,，它達(dá)到了治療癌癥的第一階段臨床試驗(yàn)，以及針對(duì)miR-122的抗iRs,，它達(dá)到了治療肝炎的第二階段試驗(yàn),。microRNAs(miRNAs)是一類非編碼RNA分子，通過與互補(bǔ)靶mRNA結(jié)合,，導(dǎo)致mRNA翻譯抑制或降解,，在細(xì)胞分化、增殖和存活過程中發(fā)揮核心作用,。

人類miRNAs的生物發(fā)生涉及四種關(guān)鍵酶-DROSHA,、Exportin 5、Dizer和Argonaute2(AGO2)的嚴(yán)謹(jǐn)調(diào)控通路,。編碼生物發(fā)生途徑相關(guān)酶的基因突變,，如DICER、DROSHA,、Exportin 1和AGO2在許多癌癥類型中都存在,，包括神經(jīng)母細(xì)胞瘤、卵巢癌和腎母細(xì)胞瘤,。同時(shí),，在體內(nèi)傳遞RNA分子的技術(shù)的進(jìn)步使基于miRNA的療法成為可能。這些構(gòu)建體在其RNA主干上具有各種修飾,，以提供更高的穩(wěn)定性和對(duì)核酸酶的保護(hù),。在最初的研究中，將裸露的miRNA模擬物,，或編碼在病毒載體中的miRNA模擬物,，系統(tǒng)地或局部地注射到目標(biāo)組織部位。

miRNA生物發(fā)生,。microRNA(miRNA)生物發(fā)生概述,，強(qiáng)調(diào)與miRNA改變相關(guān)的疾病中起作用的關(guān)鍵突變和非調(diào)控因素。miRNA是在一條嚴(yán)謹(jǐn)調(diào)控的跨物種保守的途徑中產(chǎn)生的,。miRNA的生物發(fā)生始于RNA聚合酶II的轉(zhuǎn)錄,。編碼miRNA的基因大多位于內(nèi)含子區(qū)域，并含有各自的啟動(dòng)子區(qū)域,。在RNA Pol II介導(dǎo)的長(zhǎng)初級(jí)轉(zhuǎn)錄本的轉(zhuǎn)錄之后,，產(chǎn)生成熟miRNA的兩個(gè)酶切割中的第一個(gè)開始,。DROSHA是一種III型RNase，與輔因子蛋白Dgcr8一起與初級(jí)miRNA(pri-mi RNA)轉(zhuǎn)錄本結(jié)合,。DROSHA中存在的兩個(gè)RNA酶結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)了pri-miRNAs的3個(gè)?和5個(gè)?鏈的切割,，以產(chǎn)生前miRNA。接下來,，exportin 5-Ran·GTP復(fù)合體介導(dǎo)前mRNAs從細(xì)胞核進(jìn)入胞漿,。在那里，RNaseIII Disher和TAR RNA結(jié)合蛋白(TRBP)與前miRNA結(jié)合,，并切割末端環(huán),，產(chǎn)生miRNA雙鏈。下一步,，將miRNA雙鏈摻入RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合物(RISC),。miRNA雙鏈的處理是由Argonaute(AGO)蛋白家族介導(dǎo)的，與幾個(gè)輔助因子(如PACT(也稱為PRKRA))結(jié)合在一起,。經(jīng)過解離和鏈選擇,，成熟的miRNA能夠識(shí)別目標(biāo)。成熟的miRNA與RISC結(jié)合導(dǎo)致具有互補(bǔ)位點(diǎn)的mRNAs靶向,，導(dǎo)致翻譯抑制或mRNA降解,。如圖10，14-18所示，編碼生物發(fā)生途徑相關(guān)酶的基因突變，如DICER，DROSHA，Exportin 1和AGO2,，已在許多癌癥類型中被報(bào)道，包括神經(jīng)母細(xì)胞瘤，卵巢癌和腎母細(xì)胞瘤,。

4.外泌體和lncRNA

細(xì)胞外小泡(EV)是一種小的膜性小泡，由多種細(xì)胞類型分泌,，包括凋亡小體,、微泡和外泌體。外泌體在多囊內(nèi)小體或多囊小體(MVB)內(nèi)產(chǎn)生,，并在這些小室與質(zhì)膜融合時(shí)分泌,。外泌體通過運(yùn)輸細(xì)胞內(nèi)的成分，如蛋白質(zhì),、RNA和DNA,，促進(jìn)細(xì)胞間的交流。這些外泌體成分在受體細(xì)胞中具有功能性,，并且隨來源細(xì)胞的不同而變化很大,，細(xì)胞在不同的生理和病理?xiàng)l件下可以產(chǎn)生不同的外泌體。大量研究表明，在局部和遠(yuǎn)處的微環(huán)境中,，外泌體 是腫瘤細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞之間細(xì)胞間通訊的重要媒介,。外泌體的表面分子允許它們以受體細(xì)胞為靶點(diǎn)。一旦連接到靶細(xì)胞上,，外泌體通過受體-配體的相互作用誘導(dǎo)信號(hào)傳遞,，或者通過內(nèi)吞和/或吞噬作用被內(nèi)化。另一方面,，外泌體甚至與靶細(xì)胞的膜融合,，將其內(nèi)容物輸送到其胞漿中。外泌體可以從不同的生物體液中分離出來,，例如血液,、尿液和唾液。

腫瘤微環(huán)境中的間質(zhì)細(xì)胞也利用外泌體轉(zhuǎn)移影響癌癥發(fā)生和發(fā)展的分子內(nèi)容,。MIR-21由網(wǎng)膜腫瘤微環(huán)境中鄰近間質(zhì)細(xì)胞來源的外泌體遞送,，賦予轉(zhuǎn)移性卵巢癌細(xì)胞惡性表型和化療耐藥性。在乳腺癌中,，間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)分泌的外切體可能通過轉(zhuǎn)移其分子內(nèi)容來重塑腫瘤行為,。MIR-16富含于MSC來源的外切體中，并通過靶向血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)發(fā)揮部分抗血管生成作用,。

長(zhǎng)鏈非編碼RNA(LncRNAs)在操作上被定義為超過200個(gè)核苷酸的轉(zhuǎn)錄本,，其功能沒有明顯的蛋白質(zhì)編碼功能。LncRNAs存在于細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)中,，它們可以與DNA,、RNA或蛋白質(zhì)相互作用。值得注意的是,，lncRNAs被證明通過直接或間接干擾各種癌癥的基因表達(dá),，在多種生物學(xué)過程中發(fā)揮重要作用。lncRNA也可以包裝成外切體,，在細(xì)胞間的通訊中充當(dāng)信使,。值得注意的是，一些lncRNAs富集在外體中,，而另一些幾乎不存在,，這表明一些lncRNAs選擇性地分選到外體中。特定蛋白可能作為基本的lncRNAs載體來控制lncRNA分選成外體,，但其確切的調(diào)控機(jī)制尚未完全闡明,。

孫尼替尼耐藥的腎癌細(xì)胞中基于lncARSR信號(hào)通路的基本原理。通過競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合miR-34和miR-449,，導(dǎo)致Axl/c-met的表達(dá)增加,，重新激活STAT3,、AKT和ERK信號(hào)，從而促進(jìn)了對(duì)Sunitinib的耐藥性,。反過來,，激活AKT誘導(dǎo)FOXO1或FOXO3a的磷酸化和降解，導(dǎo)致lncARSR的轉(zhuǎn)錄去抑制,，從而形成一個(gè)正反饋環(huán),。此外，lncARSR可以被包裝成外體,，并從對(duì)孫尼替尼耐藥的腎癌細(xì)胞中分泌出來,，將耐藥性轉(zhuǎn)移到受體敏感的細(xì)胞中。

5.外泌體和免疫系統(tǒng)

炎癥相關(guān)癌癥發(fā)展過程中先天和適應(yīng)性免疫細(xì)胞功能的模型,。早期腫瘤組織中存在的抗原通過樹突狀細(xì)胞(DC)轉(zhuǎn)運(yùn)到淋巴器官,，激活適應(yīng)性免疫反應(yīng)，從而產(chǎn)生促腫瘤和抗腫瘤作用,。在癌癥早期發(fā)展過程中調(diào)節(jié)DC運(yùn)輸?shù)耐緩胶涂乖拇_切性質(zhì)仍有待確定,。B細(xì)胞的激活和體液免疫反應(yīng)導(dǎo)致腫瘤組織中天然免疫細(xì)胞的慢性激活。激活的先天免疫細(xì)胞,，如肥大細(xì)胞,、粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，通過釋放有效的促進(jìn)生存的可溶性分子來促進(jìn)腫瘤的發(fā)展,，這些分子調(diào)節(jié)啟動(dòng)的腫瘤細(xì)胞中的基因表達(dá)程序,，最終改變細(xì)胞周期進(jìn)程，提高存活率,。炎癥細(xì)胞通過產(chǎn)生促血管生成介質(zhì)和胞外蛋白酶,，積極影響組織重構(gòu)和血管生成的發(fā)育。這些通路長(zhǎng)期參與的組織顯示腫瘤發(fā)展的風(fēng)險(xiǎn)增加,。相反,，適應(yīng)性免疫的激活除了抗體依賴的細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性和抗體誘導(dǎo)的補(bǔ)體介導(dǎo)的溶解外，還通過T細(xì)胞介導(dǎo)的殺傷(通過誘導(dǎo)Fas,、穿孔素和/或細(xì)胞因子途徑)來誘導(dǎo)抗腫瘤反應(yīng),。

TES在腫瘤免疫環(huán)境中的作用。a)TES呈遞腫瘤抗原,，增強(qiáng)抗腫瘤免疫：在樹突狀細(xì)胞存在的情況下，負(fù)載特異性抗原的TES能夠促進(jìn)腫瘤抗原特異性CD8+細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞的活化,。熱休克蛋白70表面陽性的TES能刺激NK細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的遷移和溶細(xì)胞活性,。b)在大多數(shù)情況下，TES作為免疫抑制因子發(fā)揮作用,。例如,，含有FasL或TRAIL的TES誘導(dǎo)T細(xì)胞凋亡,，抑制T細(xì)胞活化。攜帶轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β的TES促進(jìn)T細(xì)胞增殖,，從而抑制免疫應(yīng)答,。表達(dá)NKG2D配體或轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1的TES可通過下調(diào)NK細(xì)胞和CD8T細(xì)胞表面NKG2D的表達(dá)來抑制NK細(xì)胞和CD8T細(xì)胞的細(xì)胞毒作用。攜帶HSP72基因的TES能激活MDSCs中的STAT3,，促進(jìn)MDSCs的抑制功能,。含有miR-21-3p、miR-125b-5p,、miR-181D-5p和miR-1246等miRNAs的TES將巨噬細(xì)胞重塑為促進(jìn)腫瘤的表型,。

來自不同免疫細(xì)胞的外切體在調(diào)節(jié)癌癥免疫中發(fā)揮著不同的作用。a)攜帶MHC II的B細(xì)胞來源的外切體激活CD4+T細(xì)胞,。DC來源的外切體含有腫瘤來源的抗原,、共刺激分子和蛋白質(zhì)，可以促進(jìn)CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞的活化,。攜帶MHC I的巨噬細(xì)胞來源的外切體可以被轉(zhuǎn)移到DC,，從而使其能夠激活抗原特異性的CD4+T細(xì)胞。b)含有CD73的T-reg來源的外切體可以抑制T細(xì)胞的活化,。攜帶MHCⅠ的CD8+T細(xì)胞來源的外切體也通過抑制DC的抗原提呈來介導(dǎo)免疫抑制,。

外泌體在癌癥免疫治療中的應(yīng)用。a)由于外泌體在循環(huán)中的穩(wěn)定性高,，具有良好的水平載物轉(zhuǎn)運(yùn)能力,，已被探索作為藥物或腫瘤靶向RNAi在不同疾病中的遞送載體。此外,，外泌體還可以通過表達(dá)SIRPα,、PD1或腫瘤抗原肽等蛋白作為免疫調(diào)節(jié)劑。樹突狀細(xì)胞,、巨噬細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞等免疫細(xì)胞來源的外體可激發(fā)抗腫瘤免疫反應(yīng),。重要的是，為臨床應(yīng)用產(chǎn)生了大規(guī)模的良好制造規(guī)范級(jí)別(GMP級(jí)別)和臨床級(jí)別的外泌體,。b)攜帶GPC1,、PD-L1或某些miRNA的外泌體可能是有價(jià)值的癌癥生物標(biāo)志物。c)抑制外泌體的生物生成,、釋放和攝取是癌癥免疫治療的另一個(gè)策略,。

三.外泌體熱點(diǎn)研究分析

外泌體是近年來生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)，其在人體內(nèi)廣泛分布,，幾乎所有細(xì)胞均可以分泌外泌體,，這些外泌體既有共性也有區(qū)別，但來源于不同細(xì)胞的外泌體在不同的生理,、病理階段具有不同的功能,。隨著研究的不斷深入,，人們對(duì)外泌體的認(rèn)識(shí)一直在快速增長(zhǎng)。與其他任何一個(gè)相對(duì)較新的領(lǐng)域一樣,，外泌體是一種令人興奮的生物現(xiàn)象,，充滿了希望和疑惑。

從近幾年國自然的申報(bào)情況來看,，外泌體相關(guān)領(lǐng)域研究越來越多,，大家對(duì)外泌體的研究愈發(fā)重視，自2010年開始,，國自然審批通過的外泌體方向的研究逐漸增加,，趨勢(shì)上來看外泌體研究已經(jīng)成為國自然熱門研究方向，本期擬通過分析近幾年外泌體研究的熱門研究方向向大家說明外泌體研究的策略以及未來重點(diǎn)研究方向的走向,，幫助大家更好的完成相關(guān)領(lǐng)域的研究,。

1.外泌體腫瘤耐藥性研究

化療是腫瘤的主要治療方法之一，在控制腫瘤進(jìn)展方面發(fā)揮著重要作用,。然而,化療藥物的長(zhǎng)期應(yīng)用通常會(huì)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞對(duì)藥物產(chǎn)生耐藥性,，從而導(dǎo)致治療失敗和疾病進(jìn)展。因此,，腫瘤耐藥的機(jī)制及耐藥預(yù)防或逆轉(zhuǎn)策略一直是腫瘤治療研究的熱點(diǎn)問題,。外泌體(exosomes)是機(jī)體細(xì)胞分泌的一種直徑在40～100 nm之間的小球形囊泡，攜帶多種生物活性小分子(DNA,ncRNA,mRNA,蛋白質(zhì)等),，參與細(xì)胞微環(huán)境的調(diào)節(jié),從而調(diào)控體內(nèi)多種生理和病理活動(dòng),。近年來研究表明，外泌體作為細(xì)胞-細(xì)胞間耐藥信號(hào)傳遞的媒介,在腫瘤化療耐藥,，轉(zhuǎn)移及免疫逃逸等方面發(fā)揮重要作用,。大多數(shù)關(guān)于腫瘤耐藥性的研究都集中在腫瘤細(xì)胞本身。由腫瘤細(xì)胞分泌的外泌體充當(dāng)了腫瘤細(xì)胞之間或者微環(huán)境中的各類細(xì)胞之間通信的關(guān)鍵介質(zhì),。因此,，外泌體已成為腫瘤耐藥性研究的新模式，也成為了腫瘤生物學(xué)耐藥性研究的新熱點(diǎn),。

案例分析：

背景：奧沙利鉑耐藥是晚期結(jié)直腸癌(CRC)治療的主要挑戰(zhàn),。上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)的獲得和腫瘤細(xì)胞內(nèi)藥物積聚的抑制都有助于奧沙利鉑耐藥的發(fā)展。小分子非編碼RNA miR-128-3p的異常表達(dá)在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中起著關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用,。然而,，它在大腸癌進(jìn)展和奧沙利鉑耐藥中的作用在很大程度上還不清楚。

方法：將miR-128-3p表達(dá)的慢病毒轉(zhuǎn)染奧沙利鉑耐藥的大腸癌細(xì)胞和正常腸道FHC細(xì)胞,。轉(zhuǎn)染后分離FHC來源的外切體,，與CRC細(xì)胞共培養(yǎng)。用實(shí)時(shí)定量PCR(RT-qPCR)檢測(cè)耐藥大腸癌細(xì)胞、FHC細(xì)胞和外體中miR-128-3p的表達(dá),。RT-qPCR和Western blot分別檢測(cè)耐藥細(xì)胞miR-128-3p靶基因的mRNA和蛋白水平。采用CCK8,、流式細(xì)胞儀,、Transwell和傷口愈合試驗(yàn)、免疫熒光和原子吸收分光光度計(jì)檢測(cè)miR-128-3p對(duì)大腸癌細(xì)胞存活率,、凋亡率,、EMT、運(yùn)動(dòng)能力和藥物外排的影響,。采用異種移植模型,，觀察負(fù)載miR-128-3p的外切體在體內(nèi)是否能使大腸癌細(xì)胞對(duì)奧沙利鉑再增敏。

結(jié)果：在我們建立的穩(wěn)定的奧沙利鉑耐藥的大腸癌細(xì)胞系中,，體內(nèi)外研究顯示miR-128-3p抑制EMT,，增加奧沙利鉑在細(xì)胞內(nèi)的蓄積。重要的是,，我們的結(jié)果表明,，在晚期人類大腸癌患者中，miR-128-3p的低表達(dá)與奧沙利鉑療效差有關(guān),。此外,，數(shù)據(jù)表明，轉(zhuǎn)染miR-128-3p的FHC細(xì)胞能有效地將miR-128-3p包裝成分泌型外泌體,，并介導(dǎo)miR-128-3p轉(zhuǎn)運(yùn)到奧沙利鉑耐藥細(xì)胞,，提高了奧沙利鉑對(duì)大腸癌細(xì)胞的體內(nèi)外反應(yīng)。此外,，miR-128-3p過表達(dá)通過抑制耐藥細(xì)胞中Bmi1的表達(dá),，上調(diào)E-cadherin水平，抑制奧沙利鉑誘導(dǎo)的EMT,。同時(shí),，通過抑制藥物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白MRP5的表達(dá)，減少奧沙利鉑的外排,。

結(jié)論：結(jié)果表明,，通過外切體傳遞miR-128-3p是一種通過負(fù)調(diào)控Bmi1和MRP5來增強(qiáng)大腸癌化療敏感性的新策略。此外,，miR-128-3p可能是奧沙利鉑為主的化療的一個(gè)有前途的診斷和預(yù)后標(biāo)志物,。

大腸癌治療中基于外體miR-128-3p的信號(hào)通路示意圖。在奧沙利鉑耐藥的CRC細(xì)胞中,，來源于FHC-128細(xì)胞的外體miR128-3p通過競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合Bmi1和MRP5來逆轉(zhuǎn)奧沙利鉑耐藥,，導(dǎo)致E-cadherin表達(dá)增加(抑制EMT表型)，減少奧沙利鉑外排,。

2.外部干預(yù)刺激型外泌體研究

案例分析：

背景：轉(zhuǎn)移是肺癌死亡的主要原因,。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)是癌癥微環(huán)境的一個(gè)組成部分,，對(duì)癌癥的發(fā)展起著重要作用。腫瘤內(nèi)缺氧對(duì)癌細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞都有影響,。胞外體被認(rèn)為是細(xì)胞間通訊的媒介,。在這里，我們的目標(biāo)是進(jìn)一步闡明BMSC來源的外切體與缺氧生態(tài)位中的癌細(xì)胞之間的聯(lián)系,。

方法：使用microRNA陣列進(jìn)行外體miRNA圖譜分析,。采用肺癌細(xì)胞和小鼠體內(nèi)同基因腫瘤模型，評(píng)價(jià)選擇性外體microRNAs的作用,。評(píng)估了低氧骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞來源的血漿外體miRNAs區(qū)分癌癥患者和非癌癥對(duì)照以及有或沒有轉(zhuǎn)移的癌癥患者的能力,。

結(jié)果：我們證明了低氧骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞來源的外切體可以被鄰近的癌細(xì)胞攝取，并促進(jìn)癌細(xì)胞的侵襲和EMT,。Exosome介導(dǎo)的包括miR-193a-3p,、miR-210-3p和miR-5100在內(nèi)的特定microRNAs從BMSCs轉(zhuǎn)移到上皮癌細(xì)胞可以激活STAT3信號(hào)，增加間質(zhì)相關(guān)分子的表達(dá),。單個(gè)microRNA的診斷準(zhǔn)確性表明,，血漿外體miR-193a-3p可以區(qū)分癌癥患者和非腫瘤對(duì)照。這三組血漿胞外體microRNA對(duì)肺癌患者有無轉(zhuǎn)移的診斷準(zhǔn)確率比單獨(dú)的胞外體microRNA更高,。

結(jié)論：Exosome介導(dǎo)的miR-193a-3p,、miR-210-3p和miR-5100基因轉(zhuǎn)染可通過激活STAT3信號(hào)誘導(dǎo)的EMT促進(jìn)肺癌細(xì)胞的侵襲。這些外體miRNAs可能是癌癥進(jìn)展的有前途的非侵入性生物標(biāo)記物,。

BMSCs外體miRNAs通過STAT3介導(dǎo)的EMT促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移,。C57BL/6小鼠皮下注射LLC-RFP(含或不含骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞)。通過流式細(xì)胞儀細(xì)胞分選,，從腫瘤部位收集紅色熒光蛋白陽性的LLC細(xì)胞,，進(jìn)行RNA測(cè)序分析。上調(diào)的基因在JAK-STAT途徑中富集,。對(duì)從接受BMSCs聯(lián)合注射和LLC或LLC單獨(dú)注射的小鼠收集的LLC細(xì)胞之間的差異表達(dá)的mRNA進(jìn)行聚類,。直方圖顯示RNA-Seq獲得的STAT3轉(zhuǎn)錄本的FPKM。Western blot檢測(cè)STAT3,、p-STAT3的B蛋白表達(dá),。用常氧的BMSC分泌的外切體或缺氧的BMSC分泌的外切體處理細(xì)胞。以β-肌動(dòng)蛋白作為內(nèi)對(duì)照,。用Transwell法測(cè)定C細(xì)胞侵襲力,。STAT3抑制劑他汀類藥物可逆轉(zhuǎn)缺氧BMSC分泌的外切體增加的侵襲能力。放大倍率為100倍,。用實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)Snail和Vimentin的D表達(dá),。細(xì)胞用缺氧的BMSC分泌的外切體加或不加STAT3抑制劑他汀類藥物處理。

3.外泌體磷酸化，泛素化機(jī)制研究

案例分析：

腫瘤細(xì)胞分泌的外泌體參與了腫瘤間質(zhì)環(huán)境的重塑和促進(jìn)惡性腫瘤的發(fā)生,。然而,，控制腫瘤外切體釋放的機(jī)制仍然不完全清楚。在這里,，我們發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞外泌體的分泌是由丙酮酸激酶M2(PKM2)控制的,，該蛋白在腫瘤中被上調(diào)和磷酸化。在胞外體分泌過程中,，磷酸化的PKM2作為蛋白激酶磷酸化突觸體相關(guān)蛋白23(SNAP-23)，進(jìn)而形成SNARE復(fù)合體,，使胞外體釋放,。直接磷酸化實(shí)驗(yàn)和質(zhì)譜分析證實(shí)PKM2在Ser95位磷酸化SNAP-23。非磷酸化SNAP-23突變體(Ser95-Ala95)的異位表達(dá)顯著減少了PKM2介導(dǎo)的外切體釋放,，而選擇性擬磷酸化SNAP-23突變體(Ser95-Glu95,，而不是Ser20-Glu20)的表達(dá)則挽救了PKM2基因敲除引起的受損的外切體釋放。我們的發(fā)現(xiàn)揭示了PKM2的非代謝功能,，PKM2是一種與腫瘤細(xì)胞對(duì)有氧糖酵解的依賴相關(guān)的酶,，在促進(jìn)腫瘤細(xì)胞外切體釋放方面起著重要作用。

腫瘤細(xì)胞外切體的釋放依賴于有氧糖酵解,。(a-c)用透射電鏡(a),、WB(b)和NTA(c)鑒定從A549細(xì)胞中分離的外泌體。a中右下角的圖像代表外泌體中CD63的免疫金標(biāo)記物,。腫瘤細(xì)胞比非腫瘤細(xì)胞釋放更多的外泌體,。(e)外泌體分泌與有氧糖酵解呈正相關(guān)。(f)葡萄糖攝取量與乳酸水平之間的線性回歸,。(g)外泌體的釋放依賴于細(xì)胞的有氧糖酵解,。用紫草素(1 μM)或腫瘤壞死因子a(5 ngml-1)處理細(xì)胞，以抑制或促進(jìn)有氧糖酵解,。治療24 h后測(cè)定外切體濃度,。(h)EGF和OA對(duì)細(xì)胞有氧糖酵解的影響。值得注意的是,，EGF(10 ngml-1),，外切體釋放的促進(jìn)劑，增加有氧糖酵解,，而OA(10 mgm-1),，外切體釋放的抑制劑，減少有氧糖酵解,。(i)EGF和OA通過改變細(xì)胞有氧糖酵解來調(diào)節(jié)A549細(xì)胞外切體的釋放,。數(shù)據(jù)以平均值±S.E.M表示。并且表示每個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)具有三個(gè)重復(fù)的至少三個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)。

4.外泌體分選及分泌機(jī)制研究

案例分析：

蘇尼替尼耐藥是晚期腎細(xì)胞癌(RCC)面臨的主要挑戰(zhàn),。了解蘇尼替尼耐藥的潛在機(jī)制,，制定有效的抗耐藥策略，是臨床上迫切需要解決的問題,。在這里,，我們發(fā)現(xiàn)了一個(gè)lncRNA，命名為lncARSR(在具有蘇尼替尼耐藥的腎癌中激活的lncRNA),，它與臨床上較差的蘇尼替尼反應(yīng)相關(guān),。LncARSR通過競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合miR-34/miR-449促進(jìn)AXL和c-met在腎癌細(xì)胞中的表達(dá)，從而促進(jìn)對(duì)舒尼替尼的耐藥性,。此外,，生物活性的lncARSR可以被整合到外切體中并傳遞給敏感細(xì)胞，從而傳播對(duì)孫尼替尼的耐藥性,。靶向incARSR或axl/c-met抑制劑的鎖定核酸治療對(duì)舒尼替尼耐藥的腎癌恢復(fù)了舒尼替尼的反應(yīng),。因此，lncARSR可作為舒尼替尼耐藥的預(yù)測(cè)指標(biāo)和潛在的治療靶點(diǎn),。

lncARSR的鑒定及其對(duì)蘇尼替尼耐藥的影響,。(A)描述獲得對(duì)蘇尼替尼耐藥的腎癌細(xì)胞過程的示意圖模型。(B)左：耐舒尼替尼細(xì)胞和親本細(xì)胞的lncRNA微陣列數(shù)據(jù)顯示在熱圖中,。右圖：指示樣本中非調(diào)控LncRNA篩選流程圖,。(C)人類染色體9q82.120.717-82.185.824上lncARSR基因組位點(diǎn)的示意圖注釋。綠色矩形代表外顯子,。(D)用LNA探針對(duì)Sonitinib抗性細(xì)胞和親本細(xì)胞中的lncARSR進(jìn)行Northern blot分析,。以B-肌動(dòng)蛋白作為載藥對(duì)照。(E)定量RT-PCR分析復(fù)發(fā)組(9例),、新輔助組(12例)和初治組(8例)腎癌組織中LncARSR的表達(dá),。將lncARSR表達(dá)歸一化為b-actin(DCT)，并與最大DCT進(jìn)行比較,。數(shù)據(jù)以,？DDCT表示。(F)在舒尼替尼治療前(治療前)和在舒尼替尼治療期間疾病進(jìn)展之后(復(fù)發(fā)后),，用LNA探針對(duì)配對(duì)的腎癌組織中的lncARSR進(jìn)行LNA ISH分析,。

5.外泌體功能機(jī)制研究

胰島素抵抗是2型糖尿病的主要病理特征，老年人常出現(xiàn)胰島素抵抗,。然而,，與衰老相關(guān)的胰島素抵抗的深層次機(jī)制仍不清楚。在這里,，我們發(fā)現(xiàn)老年小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BM-MSCs)釋放的納米外切體可以被脂肪細(xì)胞,、心肌細(xì)胞和肝細(xì)胞攝取,，導(dǎo)致體內(nèi)和體外的胰島素抵抗。通過microRNA(MiRNA)陣列檢測(cè),，我們發(fā)現(xiàn)老年小鼠BM-MSCs釋放的外切體miR-29b-3p的數(shù)量顯著增加,。從機(jī)制上講，SIRT1(Sirtuin1)被認(rèn)為是外體miR-29b-3p調(diào)節(jié)胰島素抵抗的下游靶點(diǎn),。值得注意的是,，利用適體介導(dǎo)的納米復(fù)合物遞送系統(tǒng)下調(diào)BM-MSCs來源的外體中miR-29b-3p的水平，顯著改善了老年小鼠的胰島素抵抗,。同時(shí),，BM-MSCs特異性過表達(dá)miR-29b-3p誘導(dǎo)幼鼠胰島素抵抗。綜上所述,，這些發(fā)現(xiàn)提示BM-MSCs來源的胞外體miR-29b-3p可以調(diào)節(jié)衰老相關(guān)的胰島素抵抗,，這可能成為衰老相關(guān)胰島素抵抗的潛在治療靶點(diǎn)。

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